PCR反應(yīng)體系構(gòu)建引物應(yīng)遵循的原則
點(diǎn)擊次數(shù)：1632次 更新時(shí)間：2020-10-26
PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)體系是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。具有易自動化\特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、快速、重復(fù)性好等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA的片段于在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；或者可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中，擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去需要幾天甚至幾星期才能做到的事情，用PCR技術(shù)只需在幾小時(shí)以內(nèi)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)創(chuàng)舉和里程碑。
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建中引物是特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核昔酸鏈作引物，利用PCR就可將模板DNA在體外擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建引物應(yīng)遵循的原則：
1.引物長度：15-30bp，常用為20bp左右；
2.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性；
3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶；
4.引物堿基：G+C含量以40％-60％為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC一般隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串排列；
5.引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?。?/div>
6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列一般要有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處；
7.引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
引物量：每條引物的濃度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L，以Z 低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
